1926年3月20日，自感羽翼丰满的蒋介石开始走向背叛革命的道路，一手炮制了“中山舰事件”，这是他与中国共产党决裂的第一个信号。事变发生伊始，周恩来闻讯前往，也被软禁于广州铸币厂达一天之久。为此，他义愤填膺，在铸币厂打通了蒋介石的电话。蒋有点惊慌地在电话那头说：“周主任，你有何事？”
“我很遗憾，有人在两党之间制造分裂，挑拨是非，把40多名共产党员扣押在这里，我希望你能合理解决这件事情。”
“哦，所谓‘中山舰事件’，纯系有人挑拨，我不相信共产党会做这样的事！”
“本来，廖（仲恺）案发生后，我们两党曾联合一致，甄别出许多反革命分子。现在为什么又祸起萧墙呢？听说，你还下令包围了苏联顾问的住宅！”
“谣言，通通是谣言！”
“不管如何，亡羊补牢吧，请你下令释放被扣押的同志。”
慑于周恩来的威望和影响，蒋介石很快下令将他们释放了。这时，周恩来已清醒地意识到，他与蒋介石之间的裂隙越来越大，因此没有再回黄埔军校工作。
拒拉拢分道扬镳
1926年7月，国共两党决定了北伐大计，蒋介石任国民革命军总司令。出师之前，张治中请求，让周恩来担任国民革命军总政治部主任一职，以便加强两党的合作，蒋介石一口回绝道：“不必了，你实在要坚持，我看就让他担任财政委员会主任委员吧。”随后，北伐军总政治部主任邓演达也向蒋介石举荐周恩来：“我实在羡慕他的计划性和组织力，无疑，北伐有了他，将如虎添翼！”这使蒋介石不能不再次考虑重用周恩来的问题。其实，他自己也是打心眼里佩服周恩来的，他感到在国民党里，无论元老还是新秀，还没有一个人能与之相匹敌，若能得到他的帮助，对自己将是非常有利的。
为了拉拢周恩来，蒋介石装出一副礼贤下士的样子，特意宴请周恩来。席间，他对周恩来和另一位作陪的共产党员恽代英说：“你们都是我的江浙同乡，凡是同我共过事，在一起训练过军队、打过仗的共产党人，我都以知己看待。”“我希望恩来兄能与我一道北伐。”
周恩来婉转地拒绝道：“此事只能由中共中央决定，我个人难以抉择。”
“你真顽固呀，我本想请你开诚布公地谈一谈，可你……你吞吞吐吐，这样吧，等北伐胜利归来，你再回黄埔来。”
“四一二”政变发生后，周恩来与蒋介石彻底决裂。面对蒋介石的反革命嚣张气焰，周恩来冒着腥风血雨，于1927年8月1日在南昌组织领导武装暴动，由此走上了创建人民军队、武装反抗蒋介石国民党反动派的革命道路。蒋介石恼羞成怒，曾紧急下令悬赏8万元缉拿周恩来，却无果而终。
