1960年4月，王秉璋到五院上任，开始主持中国的导弹研制工作。在那个艰苦创业的火热年代，他与政委刘有光，副院长钱学森、王诤、刘秉彦等人密切配合，共同指挥了一场意义非凡的特殊战役。他们顶住了苏联撤走全部专家和拿走技术资料的压力，度过了三年自然灾害和国民经济最困难的时期，取得了震惊世界的一系列重大成果。
1960年11月5日，“东风一号”发射成功，这是仿制苏联Ｐ－2导弹的一种近程地地导弹。随后，我国导弹工业开始由仿制转入自行设计。1961年秋，王秉璋在陕西临潼主持起草了《国防部第五研究院暂行条例》，这是中国航天领域的第一部法规，标志着中国航天事业开始向正规化、科学化迈进。
1962年6月10日，刘亚楼辞去五院院长的兼职，周恩来任命王秉璋为五院院长。王秉璋在主持导弹研制工作期间，对科研生产体制实施了大刀阔斧的改革。钱学森后来说：“把大规模作战那套办法，有效地用到科技工作中来，把成千上万的科技大军组织起来了。”这种改革为发挥各方面积极性起了至关重要的作用。
1964年6月29日，“东风二号”成功发射，这标志着中国“两弹一星”事业在导弹领域取得了决定性的胜利。这枚大长中国人志气的导弹在出厂时曾经有一个小插曲。导弹组装完毕后，工作人员发现少了一颗螺丝钉。王秉璋亲临现场，要求一定要找到那颗螺丝钉。现场没有找到，有人怀疑可能掉到弹体内了。
王秉璋决定拆掉导弹。技术人员认为，这么大的导弹，少一颗小螺丝钉不会影响发射，如果分解再组装需要几个月的时间，会使军委批准的发射时间推迟好几个月。王秉璋力排众议，坚持要拆掉导弹。组装厂加班加点，用25天的时间拆掉了导弹，虽然没有找到螺丝钉，但却从弹体中发现了压垫板、铁丝、松香等杂物。
王秉璋以此为戒，对工厂进行了整顿，并建立了十多项制度。导弹运到发射基地后，又发现新的问题，他坚持泄掉已经加注的燃料进行检查，因而使发射时间又推迟了几天。他这种“不带问题出厂，不带问题上天”的严格、认真的作风，保证了导弹的成功发射。
1964年11月，五院建制撤销，成立导弹工业部，即七机部（航天部的前身），王秉璋任第一任部长。1965年2月，领导原子能工业和核武器事业的中央专门委员会决定兼管导弹工业，王秉璋被增补为中央专门委员会委员。在王秉璋的主持下，制定了一个“八年四弹”的导弹工业发展规划，并获中央批准。
1966年10月，“两弹结合”的核导弹发射成功。1966年12月26日，“东风三号”发射成功。1968年12月28日，周恩来在一次讲话中宣布：“国防科委新的党委书记……执行任务去了，他就是王秉璋同志。”王秉璋于当年10月就已经开始主持整个国防科研战线的工作。上任伊始，他就奔赴西北，成功组织指挥了第10次核试验。1970年1月，“东风四号”发射成功。1970年4月，以“东风四号”为基础的“长征一号”运载火箭成功发射了“东方红一号”人造地球卫星，揭开了中国航天史的崭新一页。1971年9月，“东风五号”低弹道飞行实验成功。
在王秉璋主持导弹研制工作期间，中国地地导弹从“东风一号”短程导弹到“东风五号”洲际导弹接连发射成功，并成功研制了多种型号的地空导弹和海航导弹。
正当王秉璋沉浸在“东风五号”洲际导弹发射成功的喜悦之中时，一场突如其来的政治风暴改变了他的命运。林彪折戟沉沙，摔死在温都尔汗。“九一三”之夜，王秉璋正在人民大会堂福建厅出席周恩来主持的会议。林彪出事后，党中央及时作出了在组织上清除“林彪的死党”的决定。
王秉璋作为红一军团和八路军一一五师的作战科科长，一直深受林彪的器重。1945年9月，林彪在冀鲁豫军区突然接到中央“万万火急”的电报，命令他转道去东北。当时任冀鲁豫军区参谋长的王秉璋正在苏北支援新四军作战，林彪想带王秉璋一同去东北，让杨得志（冀鲁豫军区司令员）打电报给王秉璋，令其速回冀鲁豫军区。王秉璋在路上遇连日大雨，耽误了行程。林彪在“万万火急”的情况下，等了他三天，最后只得北上。就这样，王秉璋没能成为四野的战将。王秉璋与林彪的这种特殊的上下级关系，当然无法逃脱受审查的厄运。
如何处理王秉璋，周恩来是非常慎重的。周恩来出席了国防科委的三次党委会。第三次时，他是坐在屏风后听会。王秉璋在会上详细讲了自己与林彪的关系。中央决定，对王秉璋停职审查。王秉璋被收审、关押了整整10年。1981年，王秉璋获释，但至今仍未作任何结论。2000年，中央文献出版社出版的最具权威的官方传记《中共党史人物传》对王秉璋作了如下评价：“他为巩固与扩大湖西抗日根据地、建设人民空军，特别是在我国导弹与航天事业的创建与发展等方面，建立了重大功绩。”但这个3万字的传记写到“九一三”事件就戛然而止，没了下文。
二十世纪五六十年代，中国的“两弹一星”事业属最高机密，其内幕世人自然难以知晓。改革开放后，关于“两弹一星”的宣传日渐增多，由于王秉璋属敏感人物，知情者有意回避，致使王秉璋领导导弹研制事业的历史鲜为人知，甚至经常发生张冠李戴的现象。在2002年底纪念罗荣桓元帅诞辰100周年的活动中，王秉璋的名字出现在中央电视台播出的电视剧《罗荣桓元帅》中，是六位顾问之一。这位密云重锁的将星在沉寂了30多年后终于露面了！
